作者姓名：儲(chǔ)昭暉
　　論文題目：水稻白葉枯病隱性抗病基因xa13的分離與鑒定的研究
　　作者簡(jiǎn)介：儲(chǔ)昭暉，男，1977年01月出生，1998年09月師從于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王石平教授，于2006年01月獲博士學(xué)位。

　　中文摘要
　　植物抗病基因的研究一直以來是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，迄今已經(jīng)從不同的宿主中分離了50多個(gè)抗病基因，其中僅有6個(gè)是隱性基因，這些隱性抗病基因的作用機(jī)理目前尚不能用廣為接受的顯性基因的作用機(jī)理來進(jìn)行解釋。水稻中已經(jīng)鑒定32個(gè)主效抗白葉枯病基因，其中9個(gè)為隱性抗病基因。位于第8染色體長(zhǎng)臂末端的xa13基因就是其中的一個(gè)典型，它完全隱性抗性、特異性的抗白葉枯病菌菲律賓菌系生理小種6（PXO99）、和其它顯性或隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作,說明xa13基因抗病機(jī)理的特異性。
　　為克隆xa13基因，采用基因組飽和雜交的原理，在9個(gè)發(fā)育時(shí)期取材構(gòu)建了水稻品種明恢63全生育期均一化cDNA文庫。以分子標(biāo)記E6a和另一端標(biāo)記S14003為起始，構(gòu)建了xa13基因區(qū)段的物理圖譜，并結(jié)合3個(gè)F2群體和Shotgun測(cè)序結(jié)果將該基因定位于一個(gè)9.2?kb的DNA片段上。同時(shí)通過精細(xì)物理定位xa13基因，開發(fā)了數(shù)個(gè)與該基因緊密連鎖的基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，為采用分子標(biāo)記輔助選擇xa13育種提供了經(jīng)濟(jì)、方便的分子標(biāo)記。
　　在優(yōu)化了一套適合于水稻品種IRBB13的轉(zhuǎn)基因組培體系的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將攜帶顯性候選基因的片段轉(zhuǎn)入到攜帶隱性抗病基因的水稻品種IRBB13中，在45株轉(zhuǎn)基因植株后代中，有全長(zhǎng)基因?qū)氲?0株的表型變?yōu)楦胁?，并?個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)基因的T1代家系也符合共分離檢測(cè)，從而驗(yàn)證了候選基因是xa13基因的顯性基因Xa13，標(biāo)志用圖位克隆法成功克隆了隱性基因xa13和顯性基因Xa13。同時(shí)，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)，分別抑制水稻品種明恢63和中花11中顯性基因Xa13的表達(dá)，以及水稻品系IRBB13中隱性基因的表達(dá)。通過接種白葉枯病菌PXO99和定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，明恢63和中花11中Xa13基因表達(dá)受到抑制的植株表型由感病變?yōu)榭共。琁RBB13中xa13基因表達(dá)受到抑制的植株抗性進(jìn)一步加強(qiáng)。
　　有趣的是，顯性基因Xa13和隱性基因xa13在花藥中的表達(dá)量高于在葉片中的表達(dá)量。RNAi轉(zhuǎn)基因植株中Xa13或xa13的表達(dá)受到抑制會(huì)導(dǎo)致植株不育或半不育，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)這些不育單株的多數(shù)花粉的發(fā)育停留在單核花粉期或二核花粉期。原位雜交的實(shí)驗(yàn)證明，?Xa13基因在花藥中表達(dá)的時(shí)期與異常花粉發(fā)生的時(shí)期非常一致，Xa13在花粉發(fā)育的早期不表達(dá)，在單核花粉期開始高水平表達(dá)。從而說明Xa13基因在花粉的發(fā)育中也起著重要的作用。
　　進(jìn)一步通過大量實(shí)驗(yàn)表明，顯性基因Xa13是一個(gè)受病原調(diào)控表達(dá)的基因，由顯性基因Xa13突變成隱性基因xa13的關(guān)鍵不是編碼區(qū)內(nèi)的變化，而是在啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)約18?bp的區(qū)間內(nèi)的突變使基因表達(dá)受病原調(diào)控的能力喪失，且這種突變不影響其在花粉中的表達(dá)。XA13蛋白是一個(gè)未知具體生化功能的細(xì)胞膜蛋白，屬于MtN3家族的成員之一。但其在白葉枯病菌PXO99侵染以及在花粉的發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能，且可能介導(dǎo)新的抗病途徑。因此，本研究通過克隆隱性基因xa13以及它的顯性基因Xa13，不僅揭示了一種新的植物抗病機(jī)制：即抑制抗病基因的表達(dá)是高效抗病的基礎(chǔ)，而且為研究植物抗病和花粉發(fā)育的關(guān)系提供了一個(gè)新的起點(diǎn)。

　　關(guān)鍵詞：??水稻；白葉枯?。稽S單胞桿菌；抗病基因；cDNA文庫；圖位克隆