作者姓名:丁?昇
  論文題目:piggyBac?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)——哺乳動(dòng)物遺傳分析的新工具
  作者簡介:丁昇,男,?1980年6月出生,2002年9月師從于復(fù)旦大學(xué)許田教授和吳曉暉教授,于2007年7月獲博士學(xué)位。

  中文摘要
  人類基因組中約有兩萬八千個(gè)編碼蛋白基因,另外還包含了很多尚未定位的同樣行使重要功能的非編碼RNA?基因和DNA?調(diào)控元件。解讀所有這些組分的功能對(duì)于認(rèn)識(shí)人類生物學(xué)及疾病具有重大的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。小鼠和人有超過99%的基因同源。通過遺傳分析方法研究小鼠基因?qū)沂救祟惢蚬δ?,發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因有非常重要的參考價(jià)值。然而,傳統(tǒng)的基因剔除、ENU?化學(xué)誘變等用于哺乳動(dòng)物的遺傳分析方法效率低、花費(fèi)大,難以大規(guī)模地分析基因功能。轉(zhuǎn)座子已在低等生物中被有效用于大規(guī)模地轉(zhuǎn)基因和基因誘變分析,在對(duì)酵母、線蟲和果蠅等模式生物的基因功能研究中起了重要作用。然而,由于缺少高效的轉(zhuǎn)座系統(tǒng),在哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)座子的運(yùn)用還相當(dāng)有限。
  我們改造了一種來源于粉紋夜蛾的DNA?轉(zhuǎn)座子piggyBac?(PB),發(fā)現(xiàn)它不僅能在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,而且能在小鼠體內(nèi)高效轉(zhuǎn)座。我們發(fā)現(xiàn)利用PB?轉(zhuǎn)座介導(dǎo)的插入誘變能在小鼠體內(nèi)有效地破壞基因功能。作為一種基因誘變工具,PB?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的優(yōu)勢在于:1)PB?轉(zhuǎn)座子能在生殖細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)座,可用簡單的交配策略快速而高效地產(chǎn)生大量可穩(wěn)定傳代的帶有單個(gè)PB?插入的動(dòng)物品系,從而繞過了傳統(tǒng)的基因剔除等誘變方法所涉及的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物手術(shù)等環(huán)節(jié),大大節(jié)約了成本,并可實(shí)現(xiàn)對(duì)沒有建立胚胎干細(xì)胞系的動(dòng)物的基因誘變;2)利用反向PCR?可方便地確定PB?插入所在的基因組位置;3)PB?插入廣泛分布于基因組中,尤其偏好基因區(qū);4)PB?插入能有效破壞內(nèi)源基因功能,與傳統(tǒng)基因剔除誘變產(chǎn)生類似的表型;5)利用PB?的精確切離可實(shí)現(xiàn)對(duì)突變表型的回復(fù),從而進(jìn)一步確定表型和基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系;6)可在交配過程中引入可見的遺傳標(biāo)記分別追蹤轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶,利用報(bào)告基因(如紅色熒光蛋白基因RFP)可憑肉眼區(qū)分PB?插入的純合子和雜合子動(dòng)物,從而提高鑒定基因型的效率,并進(jìn)一步降低了成本;7)PB?可與基因捕獲技術(shù)相結(jié)合,借助LacZ?等報(bào)告基因顯示內(nèi)源基因的表達(dá)譜。PB?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)第一次提供了在哺乳動(dòng)物基因組水平高效誘變基因的工具,有助于系統(tǒng)地研究基因功能。
  與此同時(shí),我們分別在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠體內(nèi)建立了PB?轉(zhuǎn)座介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。作為一種新的轉(zhuǎn)基因手段,PB?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在:1)整合效率高;2)負(fù)載容量大,可同時(shí)攜帶含有多個(gè)基因的大片段DNA;3)轉(zhuǎn)基因可長期穩(wěn)定地表達(dá);4)轉(zhuǎn)基因以單拷貝形式整合,更易模擬內(nèi)源基因的表達(dá)狀況;5)可用非損傷性的可見標(biāo)記代替PCR?等傳統(tǒng)方法在活體中跟蹤轉(zhuǎn)基因;6)易于確定整合位點(diǎn)。因此,PB?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)不僅可作為哺乳動(dòng)物及培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因工具,也是一種潛在的非病毒類基因治療載體。
  我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在哺乳動(dòng)物和其它脊椎動(dòng)物中建立一個(gè)作為多功能遺傳分析工具的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)邁出了關(guān)鍵性的第一步。我們希望PB?轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的應(yīng)用能進(jìn)一步推動(dòng)解析哺乳動(dòng)物基因功能的進(jìn)程,對(duì)人類生物學(xué)和疾病研究有所助益。

  關(guān)鍵詞:piggyBac?(PB),轉(zhuǎn)座子,哺乳動(dòng)物,遺傳分析,轉(zhuǎn)基因,插入誘變?